Herramientas de diagnóstico genético de las abejas de miel europeas

2022/03/01 Gorrochategui, June - Applied Genomics and Bioinformatics taldeko ikertzailea (EHU) | Galartza, Egoitz - Applied Genomics and Bioinformatics taldeko ikertzailea (EHU) | Parejo, Melanie - Applied Genomics and Bioinformatics taldeko ikertzailea (EHU) | Estonba, Andone Iturria: Elhuyar aldizkaria

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Apis mellifera o abeja de miel es en la actualidad el polinizador más importante del mundo, tanto ecológico como económicamente, y se utiliza con frecuencia para la producción de miel y la polinización de cultivos forestales. Sin embargo, estas abejas están amenazadas por diversos factores. Entre ellas, la reducción de la diversidad genética y la pérdida de subespecies locales adaptadas al medio, tienen una notable influencia, tanto por el crecimiento e importación comercial de reinas a gran escala como por la apicultura migratoria a larga distancia. Para garantizar la salud de la población mundial es necesario asegurar la conservación de las subespecies locales y mantener su herencia natural y su capacidad de adaptación. Europa es rica en el patrimonio genético de las abejas de miel (representadas por al menos 13 subespecies de 4 linajes evolutivos de 5 linajes definidos en la especie) y ha sido una región fundamental para la conservación y el desarrollo de herramientas que la faciliten. Por ello, en el marco del proyecto europeo SmartBees se ha desarrollado un microchip de ADN que permitirá la identificación de subespecies de abejas de miel europeas. Diagnóstico.- Esta herramienta facilitará e impulsará las actividades encaminadas a preservar la conservación sostenible, el comercio controlado de reinas, la verificación de productos de apicultores y el patrimonio genético de las abejas locales.

Proteger la diversidad de la miel

Las abejas de la miel (Apis melllifera) se encuentran en diversos ecosistemas, distribuidos en varias leyendas evolutivas y al menos 30 subespecies. En Europa existe una gran parte de esta diversidad, con numerosas subespecies endémicas divididas en cuatro linajes: África (A), Europa central y oriental (C), Europa occidental y septentrional (M) y Oriente Próximo y Asia Central (O). Sin embargo, la actividad humana ha ido disminuyendo progresivamente la diversidad genética de las abejas de miel europeas y su territorio natural. Precisamente por el comercio e importación de reinas y la trashumancia de larga distancia, uno de los miedos que existen es que las poblaciones de abejas de miel autóctonas adaptadas al medio se verán reducidas o perdidas, representadas por abejas no autóctonas o por simple hibridación. Está demostrado que las abejas de miel adaptadas al medio tienen una mayor capacidad de supervivencia. Por tanto, es importante fomentar el crecimiento de las abejas para que la abeja pueda durar a largo plazo.

En Europa se han puesto en marcha numerosos proyectos para la conservación y el crecimiento de las abejas de miel autóctonas, entre ellos los programas de mejora genética. El éxito depende del control del campo de fertilización y del seguimiento del origen genético de la población. En este sentido, es necesaria una herramienta de análisis genético rápido, preciso y accesible.

El proyecto SmartBees comenzó con el objetivo de desarrollar nuevas herramientas moleculares que permitieran describir y conservar la diversidad de las abejas de miel europeas. Así, mediante un muestreo exhaustivo de la abeja, se ha diseñado una herramienta compuesta por marcadores genómicos de un solo nucleótido que permite describir su diversidad genética (SNP) e identificar la subespecie de cualquier abeja europea.

Procedimiento

Se han muestreado 22 poblaciones (Figura 1) que representan a los cuatro linajes evolutivos europeos y a las 14 subespecies que se pueden encontrar en Europa y regiones próximas. Para el muestreo de las poblaciones se han tomado 100 obreras procedentes de colmenas no relacionadas entre sí. En total, más de 2.000 muestras, el muestreo más completo realizado hasta la fecha con abeja de miel europea.

Figura . Orígenes de las 22 poblaciones inicialmente muestreadas. Se han obtenido ~ 100 obreros por población, procedentes de colmenas no relacionadas entre sí. Además, cuando ha sido posible, se han tomado de diferentes colmenas. En total se han muestreado más de 2.000 abejas de miel (Melanie Parejo).

Una vez agrupadas las muestras según la población de origen, se ha extraído y secuenciado su ADN. A partir de los datos de la secuenciación se han seleccionado los marcadores genéticos con mayor información sobre el origen. Es decir, los marcadores genéticos que mejor caracterizan a las 14 subespecies de abejas de miel de Europa, superando en total los 4.000 polimorfismos mononucleótidos (SNP). Los resultados de la genotipación se han representado utilizando el diagrama t-SNE. Este diagrama agrupa las muestras de la forma más compacta posible en un mapa bidimensional, sustituyendo cada individuo por un símbolo (Figura 2). Con este método, las abejas muestreadas se han agrupado en grupos aislados (nubes de puntos) en función de su linaje evolutivo o subespecie. La única subespecie muestra del linaje africano, A. m. ruttneri, se ha situado en el centro del gráfico, entre el resto de grupos. En el linaje O, las abejas A. m. cypria han aparecido completamente separadas de tres abejas menos diferentes entre sí (A. m. anatoliaca, A. m. caucasia y A. m. remipes). Las dos subespecies del linaje M han sido bien diferenciadas, agrupando las poblaciones de A. m. mellifera en tres subgrupos. Estos subconjuntos representan regiones de muestreo remotas (región de Burzyan, Rusia, clúster supremo de A. m. mellife en la figura 1) o regiones aisladas (Isla de Læsla, Dinamarca, cluster inferior de A. m. mellife). Las muestras del linaje C se han dividido en tres subgrupos: (i) La abeja A. m. ligustica, (ii) A. m. carnica junto a varias abejas A. m. carpatica y (iii) un subgrupo heterogéneo de abejas A. m. macedonica, A. m. cecropia, A. m. adami, A. m. rodopica y demás A. m. carpatica.

Ensayos adicionales y modelo de aprendizaje automático

Además, se han genotipado otras 1.900 abejas procedentes de colmenas para la cría de SmartBees en toda Europa. Con estas 1.900 muestras, junto con las 2.000 ya genotipadas (más de 3.900 muestras en total), han elaborado un modelo estadístico que clasifica las abejas de miel europeas utilizando algoritmos de aprendizaje automático. Este modelo permite calcular la probabilidad de que una muestra sea una de las 14 subespecies europeas. Los modelos automáticos de aprendizaje tienen un lado bueno, no se basan en hipótesis previas, por lo que pueden detectar diferencias sutiles. Esta característica ha sido especialmente importante para nuestro estudio, ya que nos ha permitido diferenciar estas grandes cantidades de subespecies con una estrecha relación genética. En el artículo original (Momeni et al. 2021), se pueden encontrar más detalles sobre métodos específicos de censura.

Figura . Representación de los datos del genotipado (gráfico t-SNE) realizados con más de 4.000 SNP de cada muestra utilizada para la formación de la figura 1. Es importante recordar que el t-SNE agrupa las muestras de la forma más compacta posible para lograr la mejor agrupación. Por ello, las distancias relativas entre grupos y muestras individuales no indican una separación real evolutiva o parentesco genético. Por ejemplo, el subgrupo superior de A. m. cypria y A. m. mellife se encuentran genéticamente lejos, a pesar de aparecer comparativamente cerca en el gráfico t-SNE (Momeni et al., 2021).

Precisión en la asignación de subespecies

El modelo ha asignado correctamente la mayoría de las muestras con una precisión media del 96,2%. La mejor forma de visualizar estos resultados es mediante una matriz de confusión, que representa los porcentajes de muestras previamente clasificadas correctamente o incorrectamente (Figura 3). Las cifras de la diagonal central indican el porcentaje de muestras correctamente clasificadas, mientras que los triángulos superior e inferior representan las muestras mal clasificadas. La clasificación será errónea cuando las muestras anunciadas por el modelo y las etiquetadas sean subespecies diferentes. Estos errores se han producido, por un lado, cuando los etiquetados de las muestras ensayadas han sido erróneos y, por otro, cuando las diferencias entre las poblaciones de referencia han sido mínimas, bien por su proximidad geográfica, bien por interferencias humanas.

Para que este modelo sea aplicado en los programas y programas de conservación hemos establecido un umbral mínimo del 90%. Así, si el pronóstico de una muestra es inferior al 90%, se clasificará como “no asignado”. Si supera el límite se asignará a la subespecie correspondiente.

Retos de la diversidad y próximos pasos

La diversidad de las abejas de miel europeas ha supuesto un gran reto a la hora de diseñar una herramienta de diagnóstico de subespecies. La divergencia de los linajes evolutivos ha hecho posible que la diferenciación genética haya sido sencilla, utilizando unos pocos SNP. Sin embargo, la distinción entre subespecies ha sido más difícil debido a que la divergencia entre especies del mismo soberano ha sido reciente y, por tanto, genéticamente similares. Además, en algunas regiones europeas no están definidas las fluctuaciones del cambio de subespecies A. mellifera, y la entrada artificial de abejas extranjeras ha difuminado las fronteras naturales entre subespecies. También puede ocurrir que los programas nacionales hayan interferido en el flujo natural de los genes y alterado el patrimonio genético de la subespecie original. En consecuencia, algunas subespecies se han clasificado fácilmente mediante nuestro instrumento, mientras que otras muestras han quedado sin asignar. Sin embargo, se trata de una herramienta dinámica adaptable que permite mejorar la base de datos de referencia y/o introducir nuevas subespecies. En este sentido, teniendo en cuenta las investigaciones en curso, el método es aplicable a la siciliana A. m. de Sicilia.

Figura . Matriz de confusión con porcentajes redondeados (diagonal) de individuos realmente asignados y porcentajes de individuos asignados a cada subespecie utilizando el umbral del 90%. Algunas muestras han sido consideradas “no asignadas”, quedando excluidas de la matriz y como ocurre con ruttneri. Con la Cecropia, a pesar de la correcta asignación del 92% de las muestras, se han clasificado un 4% como Macedonica o Mellifera (Momeni et al., Adaptado de 2021).

Disponibilidad

Con este instrumento se podrá determinar el origen genético de más muestras, lo que resultará imprescindible en muchos aspectos: los apicultores podrán determinar su subespecie y grado de hibridación de abejas y dar aval a sus productos; los responsables de la conservación europea podrán controlar las tasas de hibridación de colmenas en depósitos; los veterinarios podrán controlar el comercio de reinas; y los criadores de las abejas asegurarán su subespecie de reinas.

Publicación científica completa

Agradecimientos

Esta investigación la hemos llevado a cabo con muestras de apicultores, criadores y colaboradores. Agradecemos su colaboración. El proyecto SmartBees ha sido financiado por la Comisión Europea dentro del programa FP 7 KBBE (02.01.2013, Grant nr. 613960). Melanie Parejo ha recibido subvención del Gobierno Vasco (IT1233-19).