Grandes Misterios das Células Pequenas E como os Indicadores Fluorescentes convertéronse en información

1997/05/01 Ugalde, Unai Iturria: Elhuyar aldizkaria

• Biologia

Os descubrimentos de última xeración deron a volta e media ao mundo. Por unha banda, as investigacións orientadas ao espazo leváronnos ao exterior da terra e a outros planetas. A idea de que no Universo existiron ou existen outras formas de vida é hoxe máis forte que nunca. Doutra banda, profundou nos traballos sobre a estrutura das partículas internas do átomo de viaxe ao interior, que tamén achegaron novas intencións sobre o universo. Con todo, aínda son máis as preguntas pendentes que as respostas.

A célula viva é sen dúbida a estrutura máis complexa e sorprendente do noso planeta. Por unha banda, pola súa rica información interna e a súa estrutura compacta (pensemos, por exemplo, que o programa de desenvolvemento paira a creación dunha balea almacénase en poucos nanogramos de ADN). Doutra banda, cada célula desempeña un traballo complexo nun lugar moi pequeno. En todo momento, miles de moléculas diferentes están a levar a cabo numerosas reaccións bioquímicas dentro dun plan metabólico concreto e catramílico. Ao mesmo tempo, manteñen a estrutura celular e, ademais, cumpren correctamente a súa función nun universo de células de todo o organismo (o número de células do noso sangue é superior ao da poboación mundial). Ante esta demostración, podemos pensar que a máquina máis espectacular fabricada polo home é tamén un xoguete torpe.

A maioría dos fenómenos que se producen dentro da célula son polo momento misterios. Con todo, conseguíronse algúns avances e o camiño cara á investigación está aberto.

Até hai poucos anos, as reaccións analizábanse de forma individual ou colectiva nos tubos de cristal tras a disolución das células. Esta estratexia supuxo grandes avances. Entre outras cousas, conseguiuse coñecer a estrutura e orixe, orixe e destino de moitos compostos celulares. Iso permitiu clarificar os principais procesos metabólicos como a glicolisis, o ciclo de Krebs, etc. Con todo, esta investigación, realizada fóra da arquitectura celular, puxo en oscurecimiento outros moitos detalles como a velocidade real, a localización e a dirección espacial dos procesos que se producen no interior da célula. Por exemplo, as relacións entre as neuronas no interior do cerebro non se obtiveron datos precisos, xa que nun espazo moi reducido prodúcense moitas e complexas reaccións.

Figura . Fundamentos da espectroscopia. a) Distribución das ondas da luz. b) Exemplo de absorción de luz. Absorción de luz da folla.

Co fin de superar os obstáculos mencionados anteriormente, os científicos trataron de desenvolver novas técnicas que permitan analizar estes procesos da vida mantendo a integridade celular. Estas novas técnicas baséanse na espectroscopia. É dicir, una vez que una célula completa irradiouse por ondas electromagnéticas, as ondas recibidas atravesando a célula ou por reflexión almacenan información sobre a estrutura celular. Niso consiste a técnica utilizada nas radiografías. Os raios X que obstruyen os ósos non chegan á película, o que nos permite obter información sobre a forma do óso.

Figura . As células que crecen crean un pH gradiente por diante cara atrás. A continuación móstrase un exemplo elaborado con fluorescente. ( RONCAL et a l, J. Bacteriol, 175, 879, (1993).

A arquitectura molecular dentro da célula é moi complexa, pero está composta por poucos tipos de moléculas. Por exemplo, todas as proteínas dunha bacteria (unhas 3.000) están compostas por unha combinación duns 20 aminoácidos diferentes. Descobre a fascinante habilidade da vida. O mesmo ocorre entre lípidos e hidratos de carbono. O misterio está na combinación!

Por tanto, e desgraciadamente ante as ondas electromagnéticas, todas as proteínas son similares, polo que non é posible analizar o traballo individual de cada una delas. Non é este o único problema: por unha banda, a intensidade da radiación utilizada e a lonxitude de onda (enerxía) deben estar dentro de límites que non afectan á célula. Por outra banda, as células están formadas en gran medida por auga e moitos tipos de ondas non poden utilizarse porque interferen coa auga.

Se a investigación celular ha tido que facer fronte a moitos problemas, algo parecido ocorreu cando se tratou de investigar o espazo exterior, en moitos casos utilizáronse sondas. Noutras palabras, realizáronse as máquinas adecuadas e posteriormente enviáronse ao espazo paira medir o parámetro que se pretende investigar. O sinal de medida recibímola por radio na Terra.

Nos traballos internos das células, mesmo ante os problemas mencionados anteriormente, creáronse moléculas indicadoras (ou sondas). A sonda molecular debe ser capaz de realizar o mesmo traballo que a sonda espacial dentro da célula. Basicamente as características principais deste tipo de sondas son:

1. O sinal espectroscópica (resposta ás ondas) de todas as moléculas presentes no interior da célula é totalmente distinta e totalmente separada.
2. Debe ser un indicador concreto dunha reacción ou molécula para que o investigador poida investigar os fenómenos individualmente.
3. A viaxe ao interior da célula debe realizarse sen provocar fatiga celular. Ademais, a sonda debe ter una localización específica dentro da célula e coñecida: núcleo, citoplasma, mitocondria, etc.
4. A estrutura interna e a función da célula deben ser normais no momento da medición. Evidentemente, a sonda que aglutina todas estas características
   non é fácil de crear; todas as características das máquinas que enviamos ao espazo deben ser incorporadas dentro de una molécula. Afortunadamente, a colaboración entre químicos orgánicos e bioquímicos tamén nos deu resultados espectaculares neste campo. A fluorescencia foi a súa ferramenta máis útil.

Figura . A partir da molécula de EGTA, Tsien creou numerosos tipos de sondas. Cada un con características espectrales e químicas diferentes. (Tsien, R. C EN, 18, 34, (1994).

Que é a fluorescencia?

É un fenómeno curioso que explican algunhas moléculas e que resultou moi útil. Como a luz está formada por ondas, todas as moléculas absorben a luz dunha determinada lonxitude de onda, atravesan o resto de ondas ou se reflicten á volta. Como sabemos, a clorofila é verde; se tomamos como exemplo, veremos que irradiando con luz branca absorbe a luz azul (que ten una lonxitude de onda entre 390 e 500 nm) e a vermella (que ten una lonxitude de onda entre 650 e 780 nm) e que os outros ven reflectidos á volta. A cor da luz reflectida é a diferenza entre a luz radiada branca e a absorbida: luz verde (entre 500 e 650 nm). Por tanto, todas as cousas que teñen cor quitan algo á luz branca. Os brancos nada. Os negros todo. (Ver figura 1).

Figura . Una neurona, tras recibir luz ultravioleta, mostra una resposta defensiva rápida e precisa. Na imaxe pódese apreciar una notable subida de [Ca ++ ] aos 2, 4, 5 e 6 minutos respectivamente e de arriba abaixo. Indica que o branco ^é cen veces máis alto que o azul [Ca ++ ]. ( P.B. Guthrie et ao, Nature 354 , 76, (1991)).

Que ocorre coas ondas de luz absorbidas? As ondas da luz, como calquera onda, transmiten enerxía e as moléculas que absorben as ondas pasan ao estado excitado pola enerxía recibida. Para que volva ao seu estado enerxético normal, emite esta enerxía doutra maneira. En moitos casos esta enerxía emitida é a calor formada por ondas de baixa enerxía. En casos especiais, con todo, a enerxía de excitación absorbida emítese a través doutra onda visible e a enerxía da luz emitida é sempre inferior á luz absorbida. Dito doutro xeito, a molécula excitada expulsa a luz doutra cor. E esa é precisamente a fluorescencia.

As luces negras de uso frecuente nas discotecas expulsan as ondas de alta enerxía que nós non podemos ver. Con todo, estas ondas teñen a capacidade de excitar varias moléculas. Estas moléculas excitadas emiten, á súa vez, una luz azul-esbrancuxada. Por exemplo, as camisas brancas, os dentes e a tónica aparecen coma se tivesen luz propia (por efecto da fluorescencia).

Os compostos fluorescentes naturais e artificiais son coñecidos e poden proporcionar información precisa sobre os procesos que se producen dentro da célula cando se utilizan como sonda.

Os indicadores fluorescentes utilizáronse paira medir o pH interno da célula. Os investigadores colocaron a SNARF e fluorescente, grupos que unen protones (H+), nunha molécula fluorescente. A medida que a molécula se enche de protones, as súas características de fluorescencia cambian e este fenómeno é medible.

Por outra banda, o enchido de protones depende da concentración dos mesmos. Por tanto, como se pode apreciar na figura, un cambio na concentración dos protones implica a modificación das características de fluorescencia do indicador, que tamén pode medirse con gran precisión.

Mediante este sistema experto tivéronse que introducir este tipo de fluoróforos especiais paira medir o pH interno da célula sen provocar fatiga celular. Con todo, o sistema non pode porse a traballar de calquera xeito. Quedan algúns problemas técnicos que haberá que superar e non de calquera tipo. Os grupos que unen protones teñen carga eléctrica e interactúan coa auga (son por tanto hidrófilos).

Por outra banda, a célula ten una membrana celular formada por proteínas e lípidos no bordo exterior, que controla ben o tráfico molecular entre o exterior e o interior. Este porteiro molecular non lle permite introducirse en calquera molécula cargada que non coñece e ao tratarse dun indicador fluorescente artificial, non atopa porta de entrada. (Ver 2. imaxe)

Ante este problema, os científicos conseguiron disfrazar aos grupos cargados mediante a esterificación. Con este cambio químico conséguese pasar dunha molécula hidrófila a unha hidrófoba, o que lle permite atravesar facilmente a barreira lipídica que ten diante sen pasar pola porta especial. Una vez dentro, debido á encima esterasa que contén as células, o éster hidrofóbico recupera a estrutura orixinal e o fluoroforo activo pode actuar como indicador dentro da célula.

Figura . Estrutura de cristal da proteína fluorescente verde da medusa Aequorea vitoria. ( Ormö et ao, Science, 293, 1392, (1996)).

Nalgúns casos, o indicador fluorescente queda no citosol, pero noutros se acumula en partes especiais da estrutura interna da célula. Un só cambio no grupo químico pode ter gran influencia no emprazamento celular da molécula. Por exemplo, a fluoresceína queda no citoplasma, pero a carboxifluoresq acumúlase especialmente no vaqueiro das células vexetais. Estas diferenzas utilizáronse paira a realización de estudos especiais de fragmentos celulares (ver figura 3).

As medicións de pH da célula deron resultados moi importantes, pero o traballo que máis fama deu aos indicadores fluorescentes é, sen dúbida, a medición da concentración de calcio(II) dentro da célula. As investigacións levadas a cabo nos últimos anos demostraron que este simple catión ten una gran responsabilidade no comportamento interno da célula, sendo o seu labor o do segundo mensaxeiro.

Normalmente, a concentración de calcio(II) da célula (na linguaxe dos científicos ^[Ca 2+ ]) é moi baixa no citoplasma (ao redor de 10-7 M) debido a que a maior parte ^de Ca 2+ da célula concéntrase en compartimentos especiais. Acumúlase principalmente en animais en retículo endoplasmático e plantas en vacuolas.

Tras recibir certos sinais ou estímulos externos, o calcio almacenado nos compartimentos é expulsado e o citoplasma ascende até 10 ^-5 M. Este aumento ten una gran influencia nas proteínas especiais e xera cadeas de reacción. No extremo final destas cadeas de reacción atópase a expresión dos xenes. Por tanto, é moi importante poder medir os cambios de calcio(II) dentro da célula. O primeiro ^indicador fluorescente paira medir Ca 2+ foi creado por Roger Tsien. EGTA, a partir do coñecido complexo cálcico, crea a nova estrutura BAPTA. Xestión de residuos Este cambio modifica as características espectrales de BAPTA. Desgraciadamente, o espectro de absorción do BAPTA está próximo ao resto dos compostos que contén a célula, o que leva problemas de medición. Por iso, Tsien colocou outros grupos fluorescentes mantendo o carácter molecular e as características do BAPTA, formando Quin-2, Fura-2, Indo-1 e finalmente Fluo-3 (ver figura 4).

Actualmente pódese medir a toda ^velocidade [Ca 2+ ] da célula. Estas técnicas demostraron que as respostas químicas nas células son moi rápidas e precisas (ver figura 5).

A última revolución: ver as proteínas

As proteínas son un dos actores máis representativos das células. A información codificada nos xenes exprésase en proteínas e estas son as moléculas traballadoras que realizan as diferenzas. Por tanto, ver as diferentes proteínas traballando dentro da célula foi un dos principais obxectivos que os científicos seguiron sen cansarse. Grazas á colaboración entre a enxeñaría xenética e a bioquímica publicáronse espectaculares resultados nos últimos anos.

A medusa é un animal que vive no mar e dá una luz especial.

Dentro do código de información que ten cada proteína pódese atopar o sinal da súa dirección. Este sinal atópase no extremo anterior da proteína e ábrelle todas as portas ao lugar que vai ir. Do mesmo xeito que a carta enviada por correo, a célula conduciría un complexo proceso de distribución de cada proteína. Finalmente, una vez alcanzada a proteína no seu emprazamento, o sinal de dirección elimínase e nalgúns casos sepárase doutras áreas funcionais. Noutras ocasións segue formando parte da proteína.

Algúns animais mariños conteñen proteínas que por si mesmas son fluorescentes. Debido a estas proteínas especiais, as medusas son coñecidas desde hai tempo e foron utilizadas como indicadores fluorescentes paira aclarar a dirección doutras proteínas.

As bases desta técnica espectacular son sinxelas: pódese illar previamente o xene da proteína que se quere investigar e colocar o xene do indicador fluorescente detrás ou no centro do xene; posteriormente introdúcese una nova copia no interior da célula para que continúe o seu camiño. En ausencia de artefactos, o indicador fluorescente permite obter una imaxe exacta e espectacular de cando, onde e canto fai a proteína investigada.

Á vista das innovacións existentes, pódese dicir que co uso de células vivas publicaranse moitos descubrimentos no futuro; a beleza dos resultados obtidos achegaranos moito máis que o pracer do coñecemento.