Comprenent el funcionament de les cèl·lules mitjançant l'anàlisi de sengles proteiques

2011/09/01 Azkargorta, Mikel - Biokimika eta Biologia Molekularreko Saila EHUko Zientzia eta Teknologia Fakultatea Iturria: Elhuyar aldizkaria

• Anatomia/Fisiologia
• Biokimika
• Medikuntza

Les cèl·lules són elements bàsics de la vida, les unitats dels éssers vius: tots els éssers vius estan constituïts per cèl·lules. Per exemple, es diu que els éssers humans estan formats per 70 bilions de cèl·lules. Cadascun compleix funcions específiques en l'organisme, desenvolupant milers de processos diferents que garanteixen la supervivència de l'ésser.

Les cèl·lules, en la mesura en què són també éssers vius, "neixen", creixen i moren; per a sobreviure necessiten alimentar-se i es multipliquen, entre altres coses. Per a dur a terme totes les funcions i successos es produeixen diferents processos dins de la cèl·lula. Per exemple, mitjançant un complex conjunt de reaccions anomenades metabolisme, les cèl·lules obtenen l'energia necessària per a viure. Seguint amb el cicle cel·lular, es produeix la proliferació i, finalment, quan les cèl·lules són massa antigues, moren a través del procés denominat apoptosi.

La participació de les proteïnes en tots els processos és imprescindible. Les proteïnes són molècules amb l'activitat necessària per a regular el funcionament de les cèl·lules. Cadascun dels episodis esmentats es produeix mitjançant la regulació d'un grup de proteïnes l'activitat de les quals és fonamental per al desenvolupament ordenat i eficaç dels processos.

Però les proteïnes no exerceixen el seu treball de forma aïllada, sinó que organitzen xarxes d'interacció molt complexes entre proteïnes denominades pathway o sendes. La informació per a la producció de proteïnes s'emmagatzema en una molècula anomenada ADN, organitzada en unitats denominades gens. Els gens actuen com a motlles de proteïnes i de cadascun d'ells es poden produir un o diversos tipus de proteïnes. El genoma humà té uns 25.000 gens, per la qual cosa una cèl·lula humana pot produir milers de proteïnes diferents. Cadascun d'ells disposarà d'una sèrie de funcions específiques en la cèl·lula que, com s'ha indicat, s'organitzaran en xarxes d'interacció denominades senderes.

Sengles de proteïnes

Considerem la regulació del cicle cel·lular com a exemple del funcionament d'una senda. Com ja s'ha indicat, el cicle cel·lular és un procés que les cèl·lules segueixen per a duplicar-se i és imprescindible per a la renovació cel·lular d'un organisme. Dins de la cèl·lula, i simplificant molt les coses, hi ha proteïnes que aposten pel cicle cel·lular i unes altres que s'oposen. Així, en un primer nivell de regulació, la família de proteïnes E2F afavoreix el cicle cel·lular. Les proteïnes de la família RB interfereixen en l'activitat de les proteïnes E2F, és a dir, actuen en contra del cicle cel·lular.

En un següent nivell de regulació, les proteïnes denominades CDK inactiven les proteïnes de la família RB, per la qual cosa afavoreixen el cicle cel·lular. D'altra banda, les proteïnes denominades CKI interfereixen en l'activitat dels CDK actuant contra el cicle cel·lular. Per tant, en aquest nivell s'inclouen altres dos elements, i les possibilitats de regulació del procés es diversifiquen.

A pesar que la complexitat real és molt major que la citada, aquest simple exemple serveix per a comprendre les sendes que defineixen la destinació de la cèl·lula. Les proteïnes funcionen com un interruptor: En funció de la proteïna que "s'encén" o "s'apaga", es pot estimular tant un efecte com el contrari dins de la cèl·lula. Perquè aquest tipus de processos siguin efectius, una cosa és imprescindible: la precisió. Si l'activitat d'una determinada proteïna és major o menor del necessari, poden sorgir problemes que comprometin el correcte funcionament de la cèl·lula i que, si no s'eviten a temps, poden condicionar la supervivència de l'organisme. Per tant, aquests processos han de ser estudiats i entesos en profunditat per a comprendre i combatre els danys que es produeixen com a conseqüència del seu mal funcionament.

Ratolins en el laboratori

Amb aquest objectiu es van desenvolupar els ratolins knockout (KO o -/-). Totes les cèl·lules d'un ratolí KO tenen interrompuda la funció d'un gen d'interès. Per a això, a causa de les tècniques d'enginyeria genètica, aquest gen és destruït a nivell embrionari. D'aquesta manera, la destrucció del gen dóna lloc a ratolins adults amb la falta de proteïnes que produeix. La desaparició d'una proteïna tindrà una conseqüència global: no sols desapareixerà la seva activitat, sinó que també canviarà l'activitat de les proteïnes que regula. L'anàlisi d'aquests canvis permet analitzar en profunditat les funcions que exerceix aquesta proteïna en l'organisme.

En aquest treball s'han utilitzat els ratolí E2F2 knockout (E2F2-/-). Aquests ratolins estan destruïts pel gen E2F2, per la qual cosa també tenen suspesa l'activitat de la proteïna E2F2. Encara que al principi es desenvolupen amb normalitat, amb el temps sofreixen alguns problemes. La seva caracterització va posar de manifest que l'E2F2 és imprescindible per al correcte funcionament dels limfòcits T. Els limfòcits T són una part important del sistema de defensa de l'organisme i responen davant elements aliens a l'organisme destruint-los.

Els limfòcits T sense E2F2 són molt més sensibles que els limfòcits T amb E2F2. Per això, s'oposen al propi organisme que han de defensar. Com a conseqüència d'això, els ratolins sofreixen una greu síndrome, molt semblant al Lupus Eritematós Sistèmic (ELS) dels humans, i després de diversos problemes moren abans que els ratolins amb activitat normal E2F2.

E2F2, per tant, s'oposa a l'activació dels limfòcits T dels ratolins, però a quin mecanisme respon? Per a il·lustrar-ho s'ha utilitzat en aquest treball una aproximació proteòmica. Proteoma defineix el conjunt de proteïnes d'una cèl·lula en moments i circumstàncies concretes. La proteòmica inclou, per tant, tècniques de caracterització i anàlisi de grups de proteïnes.

Llegint la presència de proteïnes

Bàsicament, en aquest treball s'ha analitzat el contingut en proteïnes dels limfòcits T dels ratolins, la qual cosa s'ha realitzat en dues situacions diferents: Quan l'activitat E2F2 és normal (estat de control denominat WT) i no hi ha activitat E2F2 ( E2F2-/- ). S'han comparat els grups de proteïnes i s'han identificat les proteïnes que es modifiquen en el cas de la desaparició de l'activitat E2F2. Així, mitjançant la determinació de les proteïnes modificades es pot analitzar el mecanisme que segueix E2F2 en els limfòcits T dels ratolins.

Per a això es van emprar tècniques d'electroforesi bidimensional (2DE) i espectrometria de masses (MS). El 2DE és una tècnica que garanteix l'anàlisi simultània de milers de proteïnes molt útil per a la comparació de proteomas. Les proteïnes es distribueixen formant taques en un suport de gel. En cadascuna de les taques es distribuirà una única proteïna i el volum de les taques és directament proporcional a la quantitat de proteïnes emmagatzemades en ella. Per tant, comparant el volum de les taques es poden detectar variacions entre les proteïnes analitzades.

Però encara que el 2DE diu que taca és diferent, no diu quina és la proteïna distribuïda en aquesta taca. Per a això és imprescindible l'espectrometria de masses (MS). Els espectròmetres de masses són aparells capaços de determinar la massa de molècules químiques amb gran precisió. Sobre la base d'aquest principi, i mitjançant cerques en bases de dades, s'identifiquen les proteïnes distribuïdes en taques diferencials.

Entre les proteïnes modificades en desaparèixer E2F2 es van trobar les proteïnes COR1A, GRB2, ARHGDIA i PAK2 que participen en les senderes d'activació dels limfòcits T. És a dir, es va comprovar que els limfòcits T sense E2F2, sense cap estímul, tenen preparada la maquinària (proteïnes) d'activació. Aquesta conclusió es correspon amb l'alta sensibilitat dels limfòcits E2F2-/-. L'experiment ens ha servit per a identificar alguns dels interruptors que E2F2 "encén" o "apaga" per a regular l'activació de limfòcits T.

En resum, els nostres resultats demostren que aquesta aproximació és útil per a comprendre el mecanisme que segueix l'E2F2 i és un exemple de les recerques que es poden utilitzar per a introduir-se en el funcionament de la cèl·lula.

BIBLIOGRAFIA